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    DNA Standards有扩增,而文库没有或Ct很大

    1、文库接头序列错误。核对文库末端序列与试剂盒提供的引物序列是否匹配。 2、稀释度过高。减少稀释倍数,重复实验。 3、文库降解。文库应现用现稀释,稀释好的文库应置于冰上备用,用完丢弃。

    稀释文库Ct超过标准曲线有效Ct范围

    1、Ct (稀释文库) < Ct (DNA Standard 1),提示文库稀释度不够,多见于过度扩增的文库。提高文库稀释倍数重复实验。 2、Ct (稀释文库) > Ct (DNA Standard 6),提示文库稀释度过高或构建失败。常规文库在1/10,000左右的稀释度时得到的Ct不应超过Ct (DNA Standard 6)。减少稀释倍数重复实验。

    文库各稀释度计算的初始文库浓度差异超过10%

    1、移液精确度差。 2、所有试剂在使用前应充分解冻并彻底混匀。 3、文库难于扩增。GC/AT含量过高或长度超过1 kb的文库扩增效率较差,定量波动性大。 4、文库降解。文库应现用现稀释,稀释好的文库应置于冰上备用,用完丢弃。

    文库各稀释度ΔCt与稀释倍数差异不一致

    1、移液精确度差。 2、所有试剂在使用前应充分解冻并彻底混匀。 3、文库难于扩增。GC/AT含量过高或长度超过1 kb的文库扩增效率较差,定量波动性大。 4、文库降解。文库应现用现稀释,稀释好的文库应置于冰上备用,用完丢弃。

    复孔重复性差

    1、移液精确度差。 2、所有试剂在使用前应充分解冻并彻底混匀。 3、仪器相关问题。确认所用ROX Reference Dye与定量仪器匹配。

    标曲扩增曲线分布不均一

    1、Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1,提示反应体系有污染。应根据NTC阴性对照的融解曲线确认污染源(文库污染或DNA Standards污染) 。 2、Ct (DNA Standard 2) - Ct (DNA Standard 1) < 3.1,提示基线(Baseline)设置不当。手动调整基线(Baseline)为1-3。 3、DNA Standards之间的ΔCt > 3.6,提示扩增效率差。确认所有试剂在使用前都已充分解冻并彻底混匀;确认所有组分浓度正确以及反应程序无误;确认每三个复孔的数据Ct≤0.2,否则去掉。 4、长时间强光照射会导致2×SYBR qPCR Master Mix荧光值下降,进而造成ΔCt > 3.6。应按照推荐方式避光贮存试剂。

    R2 < 0.99

    1、受污染影响的标准品的Ct值未舍弃。 2、所有试剂在使用前应充分解冻并彻底混匀。 3、仪器相关问题。确认所用ROX Reference Dye与定量仪器匹配。 4、移液精确度差。

    扩增效率偏出90%-110%范围

    1、如Ct (NTC) - Ct (DNA Standard 6) < 3或者Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1,且计算扩增效率超过100%,提示反应体系有污染。应根据NTC阴性对照的融解曲线确认污染源(文库污染或DNA Standards污染)。绘制标准曲线时,应先根据Ct (NTC)确定标准曲线有效Ct值范围,舍弃受污染影响的Ct,使用剩余的Ct 绘制。 2、不恰当的基线(Baseline)设置会增大Ct (DNA Standard 1),进而影响扩增效率计算。手动调整基线(Baseline)为1-3循环。 3、移液精确度差。

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